发信人: special (xxxx), 信区: Biology
标 题: western blot问题
发信站: The unknown SPACE (Tue Nov 26 00:21:55 2002) WWW-POST

我用半干转移膜，200V20mA,但开始转移不久，电流就急剧下降，转移效果非常不好，我
敢肯定不是三明治短路造成的，因为我每次都特别注意。大虾们给出个主意。。


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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 133.5.]
发信人: zzzzh (happy), 信区: Biology
标 题: Re: western blot问题
发信站: The unknown SPACE (Tue Nov 26 00:24:18 2002), 站内信件

短路电流应该会上升
是不是太干了?
【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: 我用半干转移膜，200V20mA,但开始转移不久，电流就急剧下降，转移效果非常不好，我
: 敢肯定不是三明治短路造成的，因为我每次都特别注意。大虾们给出个主意。。


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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 66.26.]
发信人: mrp (mrp), 信区: Biology
标 题: Re: western blot问题
发信站: The unknown SPACE (Tue Nov 26 00:31:10 2002), 站内信件

if u use bio-rad semidry system, the maximum voltage is 25. set current to
100-150 mA per membrane u are transfering.

【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: 我用半干转移膜，200V20mA,但开始转移不久，电流就急剧下降，转移效果非常不好，我
: 敢肯定不是三明治短路造成的，因为我每次都特别注意。大虾们给出个主意。。


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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 171.66.]
发信人: special (xxxx), 信区: Biology
标 题: Re: western blot问题
发信站: The unknown SPACE (Tue Nov 26 04:18:14 2002) WWW-POST

不好意思，我打错了，我用的是20V200mA,转移1个小时，limit设为200mA.
我用的的确是bio-rad的trans-blot，运气好的时候，电流可以维持200mA一个小时不下降
，但近来总是刚开始就急剧下降，1小时后只有50-60mA,transfer buffer 也不会有问题
。不知你们转移时，电流是否也下降得很快？

【 在 mrp (mrp) 的大作中提到: 】
: if u use bio-rad semidry system, the maximum voltage is 25. set current to
: 100-150 mA per membrane u are transfering.
:
: 【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: : 我用半干转移膜，200V20mA,但开始转移不久，电流就急剧下降，转移效果非常不好
，我
: : 敢肯定不是三明治短路造成的，因为我每次都特别注意。大虾们给出个主意。。
:
:


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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 133.5.]
发信人: zzzzh (happy), 信区: Biology
标 题: Re: western blot问题
发信站: The unknown SPACE (Tue Nov 26 12:10:29 2002), 站内信件

呵呵,半干的在室温就可以了,而且也没处放冰降温
电流下降是很正常的事情,一般我只转20-25min
【 在 Ras (很颓的猪。) 的大作中提到: 】
: 偶瞎猜的，是不是buffer太热。中间多换两次冰？
: 【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: : 不好意思，我打错了，我用的是20V200mA,转移1个小时，limit设为200mA.
: : 我用的的确是bio-rad的trans-blot，运气好的时候，电流可以维持200mA一个小时不下降
: : ，但近来总是刚开始就急剧下降，1小时后只有50-60mA,transfer buffer 也不会有问题
: : 。不知你们转移时，电流是否也下降得很快？
: : ，我


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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 152.3.]
发信人: Ras (很颓的猪。), 信区: Biology
标 题: Re: western blot问题
发信站: The unknown SPACE (Tue Nov 26 13:01:42 2002), 站内信件

反正偶试过换冰电流回升。

你的蛋白多小啊？要不就是你狂load sample.

【 在 zzzzh (happy) 的大作中提到: 】
: 呵呵,半干的在室温就可以了,而且也没处放冰降温
: 电流下降是很正常的事情,一般我只转20-25min
: 【 在 Ras (很颓的猪。) 的大作中提到: 】
: : 偶瞎猜的，是不是buffer太热。中间多换两次冰？


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一年老一年，一日没一日，
一秋又一秋，一辈催一辈，
一聚一离别，一喜一伤悲。
一榻一身卧，一生一梦里。
寻一夥相识，他一会咱一会，都一般相知，
吹一回，唱一回。

※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 152.3.]
发信人: golem (公子小岩), 信区: Biology
标 题: Re: western blot问题
发信站: The unknown SPACE (Tue Nov 26 13:31:29 2002), 转信

I guess the buffer released dissolved air after heating up. The air formed
bubbles
between the layers and thus blocked current flow.
You may want to vacuum your buffer for 5 min prior to run the blotting.

【 在 Ras (很颓的猪。) 的大作中提到: 】
: 偶瞎猜的，是不是buffer太热。中间多换两次冰？
: 【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: : 不好意思，我打错了，我用的是20V200mA,转移1个小时，limit设为200mA.
: : 我用的的确是bio-rad的trans-blot，运气好的时候，电流可以维持200mA一个小时不下降
: : ，但近来总是刚开始就急剧下降，1小时后只有50-60mA,transfer buffer 也不会有问题
: : 。不知你们转移时，电流是否也下降得很快？
: : ，我


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白银时代的人蒙神的恩宠，终身不会衰老，也不会为生计所困。
他们没有痛苦，没有忧虑，一直到死，相貌和心境都像儿童。
死掉以后，他们的幽灵还会在尘世上游荡。

※ 修改:．golem 于 Nov 26 13:36:33 修改本文．[FROM: 128.8.]
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 128.8.]
发信人: mrp (mrp), 信区: Biology
标 题: Re: western blot问题
发信站: The unknown SPACE (Tue Nov 26 13:57:58 2002), 站内信件

which transfer buffer do u use?
make sure u soak ur blotting paper with buffer completely, and remove
extra buffer outside ur blot. usually when the voltage increases to
25V, the current will decrease, but 1 hr should give u enough transfer.

【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: 不好意思，我打错了，我用的是20V200mA,转移1个小时，limit设为200mA.
: 我用的的确是bio-rad的trans-blot，运气好的时候，电流可以维持200mA一个小时不下降
: ，但近来总是刚开始就急剧下降，1小时后只有50-60mA,transfer buffer 也不会有问题
: 。不知你们转移时，电流是否也下降得很快？
: 【 在 mrp (mrp) 的大作中提到: 】
: : if u use bio-rad semidry system, the maximum voltage is 25. set current to
: : 100-150 mA per membrane u are transfering.
: ，我


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※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 171.65.]
发信人: Marble (小石头哥哥), 信区: Biology
标 题: Re: western blot问题
发信站: The unknown SPACE (Tue Nov 26 20:39:30 2002), 站内信件

you should set constant VOLTAGE instead of CURRENT.
i use semidry from BioRad, and it works very nice for my
western. set to 15V, transfer @ RT for 1hr to 1.5hr. i never
think that all the protein could be transferred onto the
membrane. and thus to make a homogenous sandwitch is very
important, which means that you treat the gel, the membrane,
as well as the blotting paper very equally well.
think about this, it is the electric field that pushes the
charged molecules to move rather than the current. if the
protein already transfer onto membrane (PVDF or Hybond ECL,
either one works for me), why should you still set very high
current? that will cause a lot of heat to melt the gel and
thus affect your blot. for a single blot 6cmX9cm, the current
@ 15V is about 150mA for me, and it drops very fast in 10min,
which means that the molecules that can move very fast has
already transferred. do a Ponceus S staining after transfer,
and acetic acid can help fix the protein.
actually, the transfer buffer i use contains 40mM glycine/
120mM glycine/0.04% SDS/15% methanol. remember that SDS will
cause heat, and an associate in my lab does not even use it.
for methanol, it is said that when the protein is large, you
can reduce it to 10%, otherwise, increase to 20%. i have used
this buffer to look at protein from 140kD to 20kD, and it
works. make 10X, add SDS/methanol when you use 1X, put it @
-20C before use. equilibrate the gel for 10minX2 @ 4C, that
helps prevent diffusion. do not put too much buffer onto the
blotting paper, and do not make it too dry either.


【 在 special (xxxx) 的大作中提到: 】
: 我用半干转移膜，200V20mA,但开始转移不久，电流就急剧下降，转移效果非常不好，我
: 敢肯定不是三明治短路造成的，因为我每次都特别注意。大虾们给出个主意。。


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※ 修改:．Marble 于 Nov 29 15:19:12 修改本文．[FROM: 128.118.]
※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 128.118.]
发信人: middlerain (不大不小，非雪非霜), 信区: Biology
标 题: Re: western blot问题
发信站: The unknown SPACE (Thu Nov 28 01:23:22 2002), 转信

我转RNA，20分钟，不过是固定电流。

【 在 zzzzh (happy) 的大作中提到: 】
: 呵呵,半干的在室温就可以了,而且也没处放冰降温
: 电流下降是很正常的事情,一般我只转20-25min
: 【 在 Ras (很颓的猪。) 的大作中提到: 】
: : 偶瞎猜的，是不是buffer太热。中间多换两次冰？


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青青子吟，悠悠我心。
但为君故，沉吟至今。

※ 来源:．The unknown SPACE bbs.mit.edu．[FROM: 128.248.]